Home

Hormony související s rozmnožováním a další

Neurohumorální řízení reprodukčních funkcí fen

Pohlavní aktivita je řízena neurohumorálně. Do jejího řízení jsou zapojeny hierarchicky uspořádané struktury mozkové kůry, limbický systém, hypotalamus, hypofýza, ovaria a děloha.

Hlavní řídící centra představují hypotalamus, hypofýza a ovaria, tzv. hypotalamo-hypofyzárně-ovariální osa. Jedná se o uzavřený okruh, kde nadřazená centra ovlivňují centra podřízená, která zpětnou vazbou ovlivňují činnost center vyšších.

 

Kůra mozková a podkorová centra

Mozková kůra a podkorová centra představující tzv. limbický systém jsou nadřazeným orgánem v řízení sexuálních funkcí.Jejich činnost ovlivňují prostřednictvím smyslových orgánů, které informují o podnětech vnějšího i vnitřního prostředí.Přicházející informace jsou analyzovány a syntetizovány v nervových strukturách limbického systému. Přenos vzruchů mezi nervovými buňkami je uskutečňován pomocí neurotrasmiterů, které se tvoří v presynaptických spojích. Cholinergní (acetylcholin) a adrenergní (noradrenalin, dopamin) pohlavní činnost vesměs stimulují a serotogenní (serotonin, melatonin) naopak inhibují. Inhibiční účinek rovněž vykazují opoidní peptidy- met-enkefalin a beta endorfin.

 

Hypotalamus

Hypotalamus je hlavní řídící centrum pohlavní aktivity. Neurální cestou přijímá podněty z nadřazených míst, z podřízených míst cestou humorální.Vykazuje dvě místa seskupení neurosekrečních buněk, které jsou bohaté na Golgiho komplex a drsné endoplasmatické retikulum. Dělí se na přední a zadní sexuální centrum.

Impulsy z rostrálního (předního) centra jsou vysílány do zadního sexuálního centra. Kromě těchto impulsů jsou zde tvořeny i biologicky aktivní oktapeptidy-antidiuretický hormon ADH a oxytocin.

V zadním- kaudální centru se tvoří neurosekrety, které stimulují nebo inhibují sekreční aktivitu hypofýzy. Neurohormony, které stimulují tvorbu a uvolňování sekretů hypofýzy představují uvolňovací faktory, tzv. liberiny, označované jako RH (z anglického releasing hormones), ty které inhibují činnost hypofýzy se nazývají statiny, označované jako IH (inhibiting hormones). Nejvýznamnější z těchto faktorů je tzv.GnRH- gonadotropní releasing hormon, uvolňovací faktor pro hypofyzární gonadotropiny, biologicky aktivní dekapeptid. Neurohormony jsou transportovány v krevním řečišti tzv.portálním systémem, kterým se dostávají k sekrečním buňkám předního laloku hypofýzy. Oxytocin tvořený v buňkách hypotalamu postupuje podle nervových vláken v podobě granul do zadního laloku hypofýzy.

 

Hypofýza

Hypofýza je tvořena dvěmi částmi - přední lalok- adenohypofýza a zadní lalok - neurohypofýza. Adenohypofýza se dále dělí na pars distalis a pars tuberalis. Větší a z funkčního hlediska hlavní pars distalis obsahuje sekreční buňky, které na základě impulsu, vyvolaného příslušný spouštěcím nebo inhibičním faktorem z hypotalamu, uvolňují neustále se tvořící adenohypofyzární hormony – tyreotropní (TTH), adrenokortikotropní (ACTH), folikulostimulující (FSH), luteinizační (LH), somatotropní (STH), luteotropní (LTH) neboli prolaktin a melanostimulující hormon(MH). Kromě prolaktinu se jedná o glykoproteidy. Prolaktin je biologicky aktivní protein.

Pro pohlavní aktivitu jsou nejdůležitější FSH a LH a prolaktin.Pars tuberalis se u fen podílí na produkci ACTH.

Do neurohypofýzy postupují podle nervových vláken granula s oxytocinem a ADH, odtud jsou uvolňovány do krevního řečiště. Kromě hypofyzárních gonadotropinů jsou známé ještě extrahypofyzární gonadotropiny, glykoproteidy, které se objevují za gravidity u klisen a žen - eCG, tvořený v endometriálních kalíšcích a hCG, produkovaný choriem.

 

Ovaria

Ovaria jsou párový orgán, který zabezpečuje pohlavní aktivitu feny. Ovariální hormony jsou tvořeny ve folikulech a žlutých tělískách.

Folikuly tvoří a produkují estrogeny, v malé míře progesteron a androgeny. Současně mají i funkci generativní.Po narození jedince je na vaječnících až několik 500 000 primordiálních folikulů, jejich počet se redukuje do období pohlavní zralosti na polovinu, dále na 35 000 v pěti letech a kolem desátého roku již jen 500.

Neustále se opakující proces růstu, zrání, ovulace a zánik antrálních folikulů je plně závislý na hypotalamo-hypofyzární aktivitě. Intraovariální mechanismy představují biologicky aktivní dekapeptidy, které se tvoří ve stěně folikulů a působí intrafolikulátně, interfolikulárně a extrafolikulárně.Tyto látky buď pozitivně nebo negativně ovlivňují působení gonadotropinů a funkční vlastnosti ovariálních struktur.Jedná se o inhibin, aktivin, fibroblastový růstový faktor, insulinu podobný růstový faktor, epidermální růstový faktor, transformující růstový faktor a inhibiční faktor pro dozrávání folikulu.

Folikuly v závislosti na stupni vývoje produkují samičí hormony, steroidní povahy- estrogeny. Hlavním estrogenem je 17 β estradiol, který se za březosti mění na estron a estriol. Substrát pro syntézu estradiolu představuje cholesterol. Estrogeny se částečně hromadí ve folikulární tekutině, větší část difunduje do krevních kapilár .

Hlavní účinky estrogenů představují stimulace růstu pohlavních orgánů, tvorba sekundárních pohlavních znaků, růst a vývoj vývodného systému mléčné žlázy, překrvení, hyperplasie a edematizace v pohlavních orgánech, otevření cervixu, stimulace tvorby cervikálního a vaginálního hlenu, zvyšování imunity, retence vody a elektrolytů, zvýšení syntézy proteinů, ukládání glykogenu, inhibice růstu kostí a jejich osifikace.

Progesteron je hlavní produkt luteální tkáně ovarií, v březosti je rovněž tvořen placentou Jedná se o biologicky aktivní steroid, jehož hlavní funkcí je udržení březosti. Svým účinkem ruší působení estrogenů. Progesteron rovněž stimuluje děložní žlázky k produkci děložního mléka, které přestavuje první výživu pro embryo. Ovlivňuje mateřské chování a vyvolává imunosupresi, která je nezbytná pro kompatibilitu matky a plodu. Rovněž zlepšuje využití živin a anabolické procesy, doprovázené zvýšením apetitu a tělesné hmotnosti.

Dalším produktem žlutého tělíska je polypeptid relaxin, který způsobuje uvolnění pánevní symfýzy, křížokyčelního kloubu a úplnou dilataci cervixu a tak se podílí na přípravě porodních cest k porodu. Spolu s estrogeny a progesteronem se podílí na stimulaci růstu mléčné žlázy.

Koncem březosti je žlutým tělískem produkován v malé míře i oxytocin, který stimuluje produkci PGF2α v děložní sliznici, který způsobuje zpětně degeneraci žlutého tělíska a jeho zánik.

Ovariální estrogeny a progesteron jsou nositeli zpětnovazebního mechanismu mezi ovarii a adenohypofýzou a jsou tak významnou složkou autoregulace pohlavních funkcí.

V endometriu dělohy se v případě nezabřeznutí vytváří biologicky aktivní lipid, odvozený od kyseliny prostanové, který je označován jako PGF2α, který určuje délku funkce žlutého tělíska. Jedná se o látku značně nestabilní, proto přechází z děložní vény přímo do ovariální artérie, aniž by došlo v periferní krvi k jeho metabolizaci na PGFM. Přesný účinek PGF2α není přesně známý, pravděpodobně se jedná o inhibici produkce progesteronu, konstrikci utero-ovariálních cév nebo destrukci LH receptorů. Tvorbu a uvolňování PGF2α předchází malé zvýšení koncentrace estradiolu, zmnožení oxytocinových receptorů a sekrece oxytocinu žlutým tělískem. V případě březosti přítomnost embryí v děloze specifickými mechanismy zabraňuje tvorbě PGF2α a tím luteolýze.

Přenos hormonů k cílovým orgánům se uskutečňuje krví. Pouze oxytocin a ADH přestupuje z hypotalamu do adenohypofýzy v podobě granul podél nervových vláken. V cílových buňkách se hormony váží na specifické receptory (KUDLÁČ a kol., 1987, DOLEŽEL a kol., 1997).

 

2.Fáze pohlavního cyklu

;Jednotlivé fáze cyklu představují specifické morfologicko-funkční změny podle převažující sekrece konkrétního pohlavního hormonu.

Během života jedince samičího pohlaví se postupně vystřídají 3 fáze z hlediska pohlavní aktivity - prereprodukční, reprodukční a postreprodukční.

Prereprodukční fáze je charakterizována postupným vývojem pohlavní soustavy s cílem dosáhnout stadia schopnosti rozmnožování. Z vrozeného počtu primordiálních folikulů se postupně vyvíjejí folikuly, které jsou schopny reagovat na podněty z nadřazených center. Pod vlivem samičích sexagenů se folikuly postupně vyvíjejí, a s nimi současně vývodné pohlavní cesty, mléčná žláza a sekundární pohlavní znaky. V pubertě - období pohlavního dospívání - se opakuje vývoj antrálních folikulů, které ale neovulují, podléhají atrézii ale s růstem a vývojem folikulů se zvyšuje hladina estrogenů, ukončuje se vývoj pohlavních orgánů a pohlavního chování.Puberta je ukončena dozráním prvních folikulů a jejich ovulací. Fena se stává pohlavně dospělou a schopnou se rozmnožovat.

Reprodukční fáze je období plné schopnosti rozmnožování. Fena patří o skupiny zvířat diestrických, u většiny plemen dochází k říji obvykle 2x ročně. U jednotlivých zvířat se jedná o vcelku pravidelné intervaly mezi říjemi, ty ale mohou být vlivem vnějších i vnitřních podmínek změněny. Meziříjové intervaly mohou například ovlivnit maligní nádory s estrogenní aktivitou, extrémy ve výživném stavu, případně i změny ve skladbě smečky.

Proestrus je charakterizován růstem a zráním folikulů, zvýšenou sekrecí estrogenů, edematizaci a hyperemii vývodných pohlavních cest. Mezi vnější známky patří především otok stydkých pysků a krvavý výtok.

V estru dochází k dozrávání folikulů s poklesem produkce estrogenů a zvyšování sekrece progesteronu. Krvavé zabarvení výtoku slábne, otevírá se děložní krček a dostavuje se svolnost k páření. Koncem estru dochází k ovulaci, která je u feny spontánní.

Metestrus je obdobím tvorby žlutých tělísek v ovulovaných folikulech se stoupající produkcí progesteronu.

V diestru dochází k maximálnímu rozvoji žlutých tělísek a sekrecí progesteronu, v případě koncepce i snížení imunity, pravděpodobně nezbytné pro kompatibilitu matky a plodů.

Anestrus je vzhledem ke dvěma říjím během roku u feny poměrně dlouhý, obvykle 4-7 měsíců. Toto období je obdobím klidu bez hormonálních aktivit, hladiny progesteronu a estrogenů jsou velmi nízké.

Postreprodukční fáze je charakterizována zánikem pohlavní aktivity. Folikuly postupně ztrácejí schopnost dozrát a ovulovat, postupně zaniká i vývoj astrálních folikulů . U feny je podle plemene toto období kolem 10 roku, podle jednotlivých chovatelský řádů je fena z chovatelských aktivit vyřazována obvykle kolem 8 roku (KUDLÁČ a kol., 1987, DOLEŽEL a kol., 1997).

 

3.Neurohumorální řízení reprodukčních funkcí samců

Reprodukční funkce jsou řízeny souhrou nervového a endokrinního systému. Nadřazeným orgánem pro řízení pohlavní činnosti je CNS. Vlastní centra řízení reprodukčních funkcí jsou umístěná v mezimozku a zadním mozku a v zadních partiích míchy.

V oblasti mozkové kůry jsou přijímány stimuly z vnějšího prostředí prostřednictvím smyslových orgánů. Po jejich zpracování jsou přesunuty do hypotalamu a hypofýzy.

V hypotalamu se nachází dvě centra, která se podílí na řízení neurohumorální aktivity. Přední rostrální sexuální centrum a kaudální sexuální centrum. S poslední lokalitou je úzce spojená hypofýza cévním spojením, které je součástí hypofyzárního portálního oběhu.

 

Hypotalamus

Hypotalamus se na kontrole sexuální aktivity podílí produkcí GnRH (gonadotropin releasing hormon- gonadoliberin). Jedná se o dekapeptid, který pulsačním uvolňováním zabezpečuje uvolňování gonadotropních hormonů z hypofýzy. U samců je hlavním zdrojem sekrece tonické centrum uložené v bazální části. Jeho funkce je ovlivňována především působením gonadálních sexagenů. jejich vyšší hladiny brzdí uvolňování GnRH a nízké hladiny naopak jeho produkci stimulují.

 

Hypofýza

Hypofýza je řazena do žláz s vnitřní sekrecí. Má dvě části a je součástí diencefalonu. Adenohypofýza řídí celou řadu dalších žláz, mezi nimi i gonády. Neurohypofýza vylučuje některé hormony, které jsou do ní transportovány z hypotalamu. Hlavní gonadotropiny jsou lutropin-LH a folitropin –FSH. Gonadotropiny jsou z chemické stránky glykoproteidy. Cílovým místem pro LH jsou Leydigovy buňky v intersticiu parenchymu varlat a vazebným místem pro FSH jsou receptory Sertoliho buněk.

 

Varlata

Sexageny- gonadální hormony jsou u samců produkovány ve varlatech Leydigovými buňkami. Zde se tvoří několik androgenů, z nichž nejdůležitější je testosteron, který je chemicky steroid. Zajišťuje vývoj samčího genitálu u plodu, v pubertě navozuje růst a rozvoj pohlavních orgánů a funkci přídatných pohlavních žláz, působí na vývoj sekundárních pohlavních znaků a ovlivňuje růst kostry a svalů. Spolu s inhibinem ovlivňuje zpětnou vazbou produkci GnRH , FSH a LH. Inhibin je peptid a byl prokázán v parenchymu varlat. Místem vzniku jsou Sertoliho buňky a jeho účinnost je směrována na kontrolu produkce FSH (VĚŽNÍK, 2004).

 

Estradiol Testosteron

 

progesteron

cholesterol

 

 

 

 

4. Biotechnologie používané při plemenitbě psů

Indukce cyklu

Jedná se o metody, které u psů přestavují především zásah do hormonálního řízení reprodukčních funkcí. Pouze v omezeném případě u fen chovaných ve smečce lze využít tzv.přirozené synchronizace cyklu. K synchronizaci ovšem dojde pouze u fen, které jsou v pozdním anestru, několik týdnů před očekávaným háráním. Někdy také nově příchozí fena do smečky začne hárat před očekávaným termínem, pravděpodobně se jedná o mechanismus, který umožní lepší zařazení feny do smečky. Naopak velmi podřízená zvířata mají délku anestru často delší, něž kdyby jejich postavení ve smečce bylo vyšší.V případě říje se může jednat o slabou, nevýraznou říji, často bez vyjádření vnějších příznaků proestru a estru.

 

Potlačování pohlavní aktivity

U fen, které se chovatelsky nevyužívají a jsou drženy jen jako hobby zvířata je často používaná metoda prodlužovaní anestru pomocí progesteronu nebo jeho depotních derivátů ve formě injekcí nebo implantátů. V současné době se celkem s úspěchem zkouší i využití imunizace proti GnRH. Jako trvalé potlačení pohlavních funkcí u fen se často využívá ovariektomie často spojená z léčebných důvodů s hysterektomií.

 

Indukce abortu

Ukončení březosti je občas chovateli využito po nežádoucím nakrytí feny. K tomuto zákroky se užívají výhradně hormonální preparáty. Časté opakování především preparátů na bázi estrogenů může vést k ovariálním cystám a následné neplodnosti zvířete.

 

Indukce a vedení porodu

Indukce a vedení porodu je obvykle indikováno ze zdravotních důvodů. Závažné onemocnění matky nebo její zranění je častým důvodem k indukování předčasného porodu, případně se indukce porodu využívá při přenášení. Vedení porodu je u fen obvyklé pouze při císařském řezu nebo jiných komplikacích, které neumožňují feně samostatně porodit. Vedení porodu a porod císařským řezem je velmi časté u plemen brachycefalických a u plemen velmi malé velikosti, kdy je počet štěňat malý a často jsou příliš velká. Plemena normálních anatomických poměrů tyto problémy při porodech většinou nemají.

Samozřejmě každý chovatel je porodu feny přítomen a musí být schopen feně případně pomoci. Stejně je samozřejmá i péče o novorozená štěňata.

 

Embryotransfer

Biotechnologická metoda, která se v praxi dosud vůbec neužívá a je prováděna pouze experimentálně. Její praktické využití, po zdokonalení kultivace embryí IV a jejich následné kryokonzervace, bude obdobné jako u hospodářských zvířat. Usnadní import a umožní mimořádně kvalitním matkám produkci vyššího počtu potomků.

 

Inseminace

Technologie, která se využívá u psů již poměrně dlouhou dobu. Pokusně počala ji v roce 1779, v současné době jsou na vysoké úrovni jak techniky nechirurgické tak chirurgické.Stejně se využívá k inseminaci spermatu čerstvého a konzervovaného.

 

5. Význam biotechnických metod

Biotechnické metody umožňují i v zájmových chovech zlepšení reprodukčních ukazatelů chovu. I v chovu psů má velký vliv ekonomika. Jednotlivé biotechnické metody umožňují především snížení nákladů na vlastní chov a produkci kvalitnějších zvířat.

Indukce cyklu umožňuje chovatelům plánovaný odchov štěňat do lepších podmínek pro jejich vývoj a zároveň i optimálnější období na prodej štěňat, případně odchov potomstva určeného pro další chovatelské a výstavní účely ve vhodném období.

Kontracepce, případně indukce abortu je využívána především majiteli fen, kteří nemají zájem na další reprodukci. Zabránění nežádoucí březosti, případně její přerušení je současně využíváno chovateli, kteří se s fenou věnují sportovním aktivitám.Současně je indukce abortu využívána chovateli při nežádoucím krytí chovné feny.

Indukce a odborné vedení porodu není u fen běžně využíváno, obvykle se provádí v případech problematické březosti či přenášení, kdy feně a plodům hrozí ohrožení zdraví nebo života.

Inseminace je často užívána z důvodů nemožnosti přirozeného krytí, ať už ze strany psa či feny. Zároveň je vynikajícím prostředkem při velké vzdálenosti chovných partnerů, případně při náročných karanténních podmínkách země jednoho ze zvířat vybraných pro plemenitbu.

Embryotransfer se u psů dosud běžně neprovádí. V budoucnu by mohl mít význam pro zvýšení počtu potomstva zvlášť kvalitních jedinců, eventuelně jejich importu.

Pro veškeré biotechnické metody, kromě indukce abortu a porodu ze zdravotních důvodů je nutné vybírat zvířata zdravá, schopná bez jakýchkoliv omezení další reprodukce. Samozřejmě musí, v případě, že se jedná o čistokrevnou plemenitbu, splňovat i podmínky, určené příslušným chovatelským klubem. Ty jsou určeny jednotlivými chovatelskými řády pro každé plemeno. Zároveň jsou některé podmínky ošetřeny i legislativně, stejně jako jejich odborné provádění.

Především výběr psů pro inseminaci musí být prováděn velmi pečlivě, protože počet potomstva u psa - plemeníka je mnohem větší než u feny- matky.

 

6. Indukce cyklu.

Přirozeným způsobem ovlivnění cyklu u fen je do jisté míry schopnost přizpůsobení estrálního cyklu fen ve smečce. Tato metoda je ovšem velmi nespolehlivá, je především ovlivněna délkou anestru a současně i sociálním postavením jednotlivých zvířat. Dominantní fena na konci anestru může zkrátit jeho délku o několik týdnů pokud ve smečce začne hárat jiná, zpravidla níže postavená fena. Naopak zvíře submisivní a na počátku anestru se 100% spolehlivostí hárat nezačne.

Ostatní metody jsou pouze na principu hormonálního ovlivnění feny.

 

Indukce cyklu pomocí gonadotropinů .

V rámci vlastních pokusů s kombinacemi eCG+hCG a FSH+LH vykazovalo estrální chování všech 11 ošetřených fen, údaje o následující březosti poněkud zkreslila skutečnost, že jedna z ošetřených fen byla v době výzkumu postižena karcinomem dělohy, který byl ovšem diagnostikován právě až po několikerém nezabřeznutí feny. U této feny bylo použito obou kombinací. Zabřezávaní z kombinace FSH+LH bylo 50% a z kombinace eCG+hCG 60%. V případě kombinace FSH+LH byla všechna ošetřená zvířata v poslední třetině anestru (120- 180 den po předcházejícím estru), takže zkrácení cyklu bylo maximálně o 6 týdnů. Všechna zvířata použitá v pokusu byla před jeho započetím krytá během přirozeného cyklu s následnou dokončenou březostí. FSH (Folicotropin) byl podáván v dávce 500 IU s.c. 5 dní a LH (Humegon) 75 IU s.c. 5 dní, hCH ( Pregnyl) 500 IU i.m. 10 dní a eCG( Sergon) 250 IU i.m. jednorázově.

 

Indukce cyklu pomocí PGF2α a estradiolu

Pro indukci cyklu u fen byl na základě poznatků o délce diestru nezabřezlých fen (až 80 dní po estru) a přetrvání CL byla vyzkoušena kombinace luteolytického PGF2α a estradiolu β 17. U 13 ošetřených fen projevovalo estrální chování 69,2 % zvířat, včetně ochoty ke krytí. Z 9 krytých fen ani jedna nezabřezla. Byly použité preparáty Agofollin v dávkování 5mg/ zvíře, s.c., ob den celkem třikrát, a Dinolytic v dávce 0,05 mg / kg 2x během jednoho týdne.

 

Tab. 2 Indukce estru

Hormonální kombinace

Počet ošetřených zvířat

Estrální chování

březost

Průměrný počet štěňat ve vrhu

PGF2α + estradiol

13

9

0

0

hCG + eCG

5

5

3

5,3

FSH + LH

4

4

2

4,0

 

Indukce cyklu ergotaminderiváty

V rámci vlastního výzkumu byl u indukován estrus pouze u jedné feny preparátem Bromocriptin pod obchodním názvem Medocriptin tbl. 2,6 mg. Fena v poslední třetině ( 120. den) anestru počala hárat za 9 dní denní aplikace 0,02mg/kg tj. 0,6 mg denně p.o. Během indukovaného cyklu byla krytá a normálně zabřezla a porodila 5 štěňat.

 

 

7. Inseminace

Pro inseminaci bylo určeno celkem 27 fen, 4 feny Yorkshire teriér, 1 jezevčík, 1 Cavalier Charles spaniel, 1 anglický kokršpaněl, 2 feny maltézského psíka, 1 bordeauxská doga a 17 fen plemene německý ovčák. Pouze u 5 případů se jednalo o nezájem psa o fenu, přičemž feny vykazovaly normální estrální chování, včetně akceptace psa. Ostatní feny buď vykazovaly normální estrální chování pouze vůči známému psu a vybraného plemeníka odmítaly nebo nestrpěly vůbec žádný těsnější kontakt s jakýmkoliv psem. U fen, které všechny psy odmítaly byla denně prováděna vaginální cytologie a palpační vyšetření na stanovení optimálního období na provedení inseminace.

U 7 fen byl použit na zklidnění pro provedení inseminace použitý preparát Xylazin v dávkování 1ml/30 kg. Jednalo se o zvířata, která nebylo možné šetrně zafixovat pro provedení inseminace.

Před vlastní inseminací byl u každého plemeníka proveden odběr za účelem vyšetření ejakulátu. Ejakulát byla bezprostředně po odběru mikroskopicky zhodnocena motilita spermií, orientačně posouzena koncentrace spermií v ejakulátu a bakteriální kontaminace. Makroskopicky byl ejakulát posouzen, zda neobsahuje nežádoucí příměsi, především krev a moč.

Odběr semene od vybraných plemeníků byl prováděn manuálně do vyhřáté sterilní skleněné nádobky se zaoblenými okraji ( prevence poranění penisu) za přítomnosti háravé feny. Po ejakulaci spermiové frakce následoval vždy odběr postspermiové frakce v délce 10 minut. Takto získané semeno bylo ihned po odběru nabráno do sterilní skleněné stříkačky o objemu 20 ml a pomocí plastového katetru, nasazeného na stříkačku, bylo aplikováno vaginálně, co nejblíže krčku. Délka zavádění katetru byla určena poměřením délky penisu odebíraného psa. Po aplikaci semene byla vždy prováděna stimulace svázání pomocí 1 nebo 2 prstů ( podle velikosti feny) po dobu 15 minut.

V případě malého množství odebraného spermatu bylo pro naředění použité žloutko-mléčné ředidlo ( 1 díl žloutku + 5 dílů plnotučného mléka, zahřáté na 95°C po dobu 10 min.) Příprava ředidla probíhala bezprostředně před odběrem semene, ředění semene bylo 1:3. Toto ředidlo bylo zároveň použité i pro transport a krátkodobou konzervaci na dobu 3 dnů. Transport probíhal v termoboxu, v případě krátkodobé konzervace bylo semeno postupně zchlazováno v průběhu 2 hodin na 6° C. Při této teplotě bylo semeno také uskladněno.

Inseminace byla u všech fen opakována nejméně 3 dny za sebou.

Ve 3 případech byly feny inseminovány ředěným a chlazeným spermatem.

Tyto feny byly inseminovány 6x, v 6ti po sobě jdoucích dnech.

 

Tab. 3. Přehled inseminovaných fen

 

Počet fen

březost

porod

Čerstvé semeno,neředěné

18

15

15

Čerstvé semeno,ředěné

6

4

4

Chlazené

semeno, ředěné

3

1

1

 

 

8. Indukce abortu

Indukce abortu bylo využito v případě nežádoucího krytí a ve 3 případech pro zdravotní obtíže matky. Jednalo se pokaždé o hrozící abort, s ultrazvukovou kontrolou stavu plodů. Vždy se v děloze nacházely nejméně dva mrtvé plody, a tak byl pro možnost ohrožení života feny indukován potrat. Ve všech případech se jednalo o březost do 6. týdne, živě narozené plody byly neživotaschopné a během několika hodin uhynuly.

K indukci abortu byly využity celkem 3 kombinace účinných látek.

Jako první byl využíván Agostilben (diethylstilbesterol) s.c.. Vysoká koncentrace estrogenů v plasmě bezprostředně po krytí má za následek inhibici implantace embryí. V současné době se i obecně využívá více Agofollin ( estradiol) s.c.. U všech ošetřených fen došlo k opětovnému nástupu proestru a estru.

Remophan (Dexcloprostenol) v dávce 2,5 μg/ kg i.m. po čas pěti dnů a současné podávání Bromocriptinu v dávce 0,02 mg/ kg p.o. živé hmotnosti bylo použité u pěti fen. U všech ošetřených feny Bromocriptinem docházelo během jeho aplikace ke zvracení cca do 20 minut po podání.

U pokročilejší březosti byl využít PGF2α (Dinolytic) i.m., nebo jeho analog Remophan. Při aplikaci Dinolyticu nevykazovala ošetřená zvířata žádné vedlejší účinky, naopak Remophan vyvolal u ošetřených fen do 10 minut zvracení a během dalších 30 minut průjem.

U všech ošetřených zvířat březost nepokračovala, po ošetření estradiolem se dostavila další říje, jejíž fertilita nebyla vyzkoušená- jednalo se vždy o nežádoucí krytí, bez zájmu majitele feny o odchov štěňat. Při ošetření fen PGF2α, případně jeho analogem, ať už samostatně nebo v kombinaci s Bromocriptinem došlo u všech ošetřených fen k abortu.

Tab.4 Indukce abortu

preparát

Počet ošetřených zvířat

Pokračující březost

estradiol

11

0

PGF2α nebo jeho analog

4

0

Bromocriptin + PGF2α nebo jeho analog

5

0

analog PGF2α – Remophan, v dávce 2,5μg/kg 5 dní i.m.

estradiol- Agofollin v dávce 1ml/zvíře , třetí, pátý a sedmý den p.c.

PGF2α – Dinolytic v dávce 0,05mg/ kg 5 dní od poloviny březosti, i.m.,s.c.

Bromocriptin v dávce 0,02mg/ kg 10 dní a Remophan 3x v dávce 1,5μg/kg p.o.

 

 

 

9. Indukce a vedení porodu

Vedení porodu bylo u sledovaných fen vždy indikováno pouze v případě protrahovaného porodu, kdy hrozilo uhynutí plodů.

Byl využit Oxytocin, Depotocin, Remophan, Dinolytic a infuzní roztok ve složení: Ca 10% 0,5 ml /kg + glukóza 10% 1ml/kg a Oxytocin 1 m.j, opakovaně až 3x po 45 minutách. Pouze v jednom případě byl použitý císařský řez. Fena po porodu prvního štěněte nevykazovala žádné kontrakce, ani po opakované aplikaci oxytocinu, pohybové a tepelné terapie. V případě tohoto porodu všechna štěňata, normálně donošená a bez zjevných vad, během 3 dnů uhynula. Pitva nebyla provedena. Fena během dalších porodů neměla žádné obtíže, porod probíhal vždy normálně.

V 6ti případech byl oxytocin použitý na obnovení kontrakcí, které během prodlouženého porodu extrémně velkého plodu vymizely. Jednalo se o feny malých plemen a průběh porodu nebyl majiteli sledován a péče o fenu byla zanedbána. Po aplikaci oxytocinu byly plody, uvízlé v porodních cestách vybaveny manuálně vaginální cestou.

Pro vyhodnocení aplikace jednotlivých preparátů v následující tabulce byla využita zvířata z CHS z Gilanu, celkem 57 vrhů.

 

Tab.5 Preparáty použité při vedení porodu

 

Počet ošetřených fen

Počet živě narozených

štěňat

Počet mrtvě

narozených

štěňat

Počet

štěňat

celkem

Oxytocin

17

88

14

102

Depotocin

6

26

5

31

Remophan

3

5

9

14

Dinolytic

4

22

2

24

Infuze

3

19

7

26

 

 

10. Stanovení optimální doby inseminace

S ohledem na menší životnost spermií u chlazeného a mraženého semene je pro optimální čas inseminace vhodné využít laboratorních metod. Pouze u inseminace přímo čerstvým, nejlépe neředěným ejakulátem, lze pro období inseminace možné využít vnějších příznaků estru a chování feny. Jedná se především o případy, kdy je fena ke krytí svolná, ale vybraný plemeník není z jakéhokoliv důvodu fenu přirozeně nakrýt. U fen, které nevykazují normální estrální chování je i při inseminaci čerstvým semenem nutné určit čas inseminace laboratorně.

 

Vaginální cytologie

Cytologické vyšetření vaginálního stěru využívá změn struktury poševního epitelu, která se mění podle hormonálních změn, probíhajících v proestru a estru.

Buněčný materiál se odebírá pomocí tampónu, který je nejlépe pomocí vaginoskopu zaveden do pochvy. Vaginoskop se zavede do pochvy tak, aby se zabránilo kontaminaci buňkami z vaginálního vestibulu, který se rozkládá mezi stydkými pysky a vyústěním močové trubice.

Pomocí vaginoskopu se zasune tampon, navlhčený fyziologickým roztokem a zpětným setřením se provede stěr.

Odebraný materiál se přenese na podložní sklíčko, materiál se zafixuje (např.metanol) a obarví.Metod na barvení cytologického materiálu je uvedeno několik, pro vaginální cytologii je vhodné polychromatické barvení. Klasická metoda polychromatického barvení je barvení podle Papanicolau, kdy se zrohovatělé superficiální buňky barví červenooranžově a ostatní modrozeleně.Dalším polychromatickým barvení je barvení podle Kubíčka, zrohovatělé buňky se barví oranžové a ostatní buňky šedozeleně. Při dostatečné zkušenosti lze využít jednoduché barvení používané v hematologii- Giemsa Romanowski nebo Diff Quick. V tomto případě se diagnóza stanovuje především podle tvaru buněk.

Kriteriem pro posouzení cytologického nálezu je velikost epiteliálních buněk, poměr mezi jádrem a cytoplasmou a tvar buněk.

Během anestru se ve vaginálním stěru nachází především bazální a parabazální buňky, které na počátku proestru mizí a objevují se buňky intermediální a superficiální.Současně je možné nalézt erytrocyty a leukocyty. S přechodem do estru plynule přibývají superficiální buňky, které postupně rohovatí. Těsně před ovulací se v nátěru nachází převážně jen zrohovatělé superficiální buňky (80-90%). Další vyšetření ukázala, že 75% fen ovuluje první den maximálního zrohovění. Doba maximálního rohovění trvá 1-6 dní.

Konce estru se zrohovělé superficiální buňky v nátěru nachází ve svazcích, a během 2. až 4. dne metestru se v nátěru nachází opět leukocyty, které se podílí na regeneračních pochodech poševního epitelu. Během metestru se v nátěru vyskytují modifikované parabazální buňky, které mají vakuolizovanou cytoplasmu a metestrální buňky, což jsou parabazální buňky s neutrofilními granuly v cytoplasmě (KELLER, 2003).

 

Vaginoskopie

Pomocí vaginoskopu lze podle změn na epitelu pochvy určit období před ovulací a den ovulace.Strukturální změny jsou způsobené zvýšenou hladinou estrogenů během proestru a následně zvyšující se hladinou progesteronu krátce před ovulací

 

Stanovení optimálního termínu inseminace pomocí hladiny progesteronu v plasmě.

Maximální koncentrace estrogenů je v období proestru, zhruba 1-2 dny před nástupem vlastního estru. Kombinace zvyšující se hladiny progesteronu a současný pokles koncentrace estrogenů vede k estrálnímu chování feny a svolnosti ke krytí. V tomto období začíná vlivem LH tvorba progesteronu, která je během anestru a během téměř celého proestru pod bazální hladinou 0,5ng/ml. Preovulační vzestup hladiny LH ( LH peak) trvá 1-2 dny a průměrně za 2-3 dny se dostavuje ovulace.

Graf 5 Hladina progesteronu během cyklu a gestace (Benetti a kol., 2004)

 

Graf 6 Hladina estadiolu během cyklu a gestace(Benetti a kol., 2004)

 

Hladina progesteronu se koncem proestru se zvyšuje nad hladinu 1 ng/ ml. Luteinizací folikulárních buněk dochází k dalšímu zvyšování hladiny progesteronu, v období LH peaku dosahuje úrovně asi 2,6±0,3 ng/ml. Během ovulace jsou zjišťovány hodnoty na úrovni 4,8-6 ng/ml. Pokračující nárůst koncentrace progesteronu v séru je velmi individuální, závisí na celkovém počtu žlutých tělísek. Obecně lze říci, že u středních plemen dochází k většímu počtu ovulovaných oocytů než u plemen malých a velkých, a tudíž u nich dochází k rychlejšímu nárůstu koncentrace progesteronu v plasmě.

U plemen s málopočetnými vrhy zaniká schopnost oocytů oplození při koncentraci 11ng/ml a u velkých plemen kolem 17 ng/ml.

 

Tab.18 Stanovení optimální doby k inseminaci

Progesteron

Fáze cyklu

Termín krytí,inseminace

> 2 ng/ml

proestrus

Opakované vyšetření za 3-5dní

2-3ng/ml

LH peak

Za 3-4 dní

3,1-4,5 ng/ml

Po LH peaku

Za 2-3 dny

4,6-8 ng/ml

Po ovulaci

Za 1-2 dny

8,1-16 ng/ml

Konec fertilního období

ihned

 

Tab.19 Celková úspěšnost zabřezávání podle koncentrace progesteronu (Vitásek a kol., 2001)

rok

Počet fen

březí

%

nezabřezlé

%

1998

42

30

71

12

29

1999

78

63

80

15

19

celkem

120

93

77,5

27

22,5

 

Ve studii autor uvádí celkem 25 konkrétních případů stanovení období krytí nebo inseminace podle sérového progesteronu. V případě, že hladina progesteronu byla na 7,4 byly feny kryty nebo inseminovány ihned ( rozmezí progesteronu od 7,4 do 18 ng/ml) při hladinách nižších s prodlením 1 – 4 dny. Pro inseminaci byly vybrané feny s hladinou progesteronu 18( fena azavak, zabřezla), 11,92 ( kernteriér, zabřezla) a 5,1 (jezevčík, zabřezla).